研究背景：

RNA的N6-甲基腺苷（m?A）修飾是真核生物中普遍的內(nèi)部RNA化學(xué)修飾，被譽(yù)為“表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)"的核心調(diào)控層。過(guò)去十年的大量研究揭示了m?A在信使RNA（mRNA）的代謝、剪接、翻譯和降解中扮演關(guān)鍵角色，并通過(guò)其“閱讀蛋白"（如YTHDF家族）執(zhí)行功能，進(jìn)而廣泛影響細(xì)胞生理與病理過(guò)程，包括腫瘤發(fā)生。YTHDF2是其中重要的閱讀蛋白，其主要功能是識(shí)別m?A修飾并促進(jìn)靶標(biāo)mRNA的降解。

然而，絕大多數(shù)研究集中于mRNA和長(zhǎng)鏈非編碼RNA，對(duì)于m?A修飾在種類(lèi)繁多的“自我"非編碼RNA（尤其是具有核心細(xì)胞功能的snRNA）上的作用知之甚少。U6 snRNA是剪接體的關(guān)鍵組成部分，傳統(tǒng)認(rèn)知中其功能?chē)?yán)格限定在細(xì)胞核內(nèi)的pre-mRNA剪接。近年來(lái)，研究發(fā)現(xiàn)U6 snRNA在癌細(xì)胞中高表達(dá)，且可被METTL16進(jìn)行m?A修飾，但其在細(xì)胞質(zhì)中的命運(yùn)和生理病理功能是一個(gè)未解之謎。

同時(shí)，慢性炎癥是多種癌癥的關(guān)鍵驅(qū)動(dòng)因素，而紫外線（UVB）是誘導(dǎo)皮膚炎癥和皮膚癌的主要環(huán)境因素。盡管已知Toll樣受體3（TLR3）能識(shí)別外源雙鏈RNA引發(fā)免疫反應(yīng)，但其如何被內(nèi)源性RNA激活并參與腫瘤發(fā)生，機(jī)制尚不明確。本研究正是在此背景下，探索m?A修飾的自我非編碼RNA（以U6 snRNA為代表）是否以及如何通過(guò)YTHDF2閱讀蛋白，調(diào)控天然免疫應(yīng)答和腫瘤發(fā)生，從而連接表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)、炎癥與腫瘤三大領(lǐng)域。

研究方法：

本研究采用多層次實(shí)驗(yàn)方法以闡明YTHDF2通過(guò)m?A U6 snRNA調(diào)控炎癥與腫瘤的機(jī)制。

在分子與細(xì)胞水平，研究者利用RNA干擾、基因敲除與過(guò)表達(dá)技術(shù)，結(jié)合RNA-seq和qPCR，旨在驗(yàn)證YTHDF2缺失對(duì)炎癥通路的關(guān)鍵作用。通過(guò)m?A-seq、RNA免疫沉淀和體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)，旨在發(fā)現(xiàn)并證實(shí)YTHDF2直接結(jié)合m?A修飾的U6 snRNA并介導(dǎo)其降解。使用TLR3抑制劑、基因敲低及LRR結(jié)構(gòu)域突變體，旨在證明U6通過(guò)TLR3的LRR21域激活炎癥。

在亞細(xì)胞定位層面，采用內(nèi)體分離、免疫熒光和FISH技術(shù)，旨在揭示YTHDF2與U6通過(guò)SIDT2轉(zhuǎn)運(yùn)至內(nèi)體并發(fā)生功能互作。

在動(dòng)物模型與臨床關(guān)聯(lián)層面，構(gòu)建皮膚特異性YTHDF2敲除小鼠并進(jìn)行UVB致癌實(shí)驗(yàn)，旨在證實(shí)YTHDF2在活體水平抑制炎癥與腫瘤發(fā)生。通過(guò)分析人類(lèi)皮膚癌組織芯片與自身免疫病數(shù)據(jù)庫(kù)，旨在闡明YTHDF2表達(dá)的臨床相關(guān)性。

多種方法層層遞進(jìn)，揭示從RNA修飾到免疫激活的全新信號(hào)軸。

主要研究結(jié)果：

1、YTHDF2控制炎癥基因表達(dá)

研究通過(guò)RNA-seq和體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)YTHDF2是炎癥的關(guān)鍵負(fù)調(diào)控因子。在人類(lèi)角質(zhì)形成細(xì)胞中敲低YTHDF2會(huì)顯著上調(diào)TNF、IL-17和TLR3等炎癥通路相關(guān)基因。在構(gòu)建的皮膚特異性YTHDF2敲除小鼠模型中，UVB照射誘導(dǎo)了更嚴(yán)重的皮膚炎癥，表現(xiàn)為表皮增厚、CD45+免疫細(xì)胞浸潤(rùn)增加。在細(xì)胞水平，敲低YTHDF2增強(qiáng)了UVB誘導(dǎo)的TNF-α、IL-6、COX-2等關(guān)鍵炎癥因子的表達(dá)，而過(guò)表達(dá)YTHDF2則抑制這一過(guò)程。此外，臨床數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，YTHDF2在系統(tǒng)性紅斑狼瘡和I型糖尿病患者中表達(dá)下調(diào)。這些結(jié)果共同確立了YTHDF2在抑制炎癥反應(yīng)中的核心地位。

圖1 YTHDF2控制炎癥基因表達(dá)

2、YTHDF2結(jié)合m?A修飾的U6 snRNA并誘導(dǎo)其降解

為探究YTHDF2調(diào)控炎癥的機(jī)制，研究發(fā)現(xiàn)了其非編碼RNA新靶點(diǎn)——U6 snRNA。雖然m?A-seq未找到典型的炎癥基因靶標(biāo)，但通路分析提示非編碼RNA代謝重要。質(zhì)譜分析顯示YTHDF2與多個(gè)U6 snRNP蛋白互作。后續(xù)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，YTHDF2敲低或UVB照射均能顯著提升U6 snRNA水平，而過(guò)表達(dá)YTHDF2則降低其水平。通過(guò)RIP和m?A-IP實(shí)驗(yàn)，證明YTHDF2直接結(jié)合U6 snRNA，且該結(jié)合依賴(lài)于METTL16催化的m?A修飾。RNA穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)表明，YTHDF2通過(guò)促進(jìn)U6降解來(lái)調(diào)控其豐度，揭示了其超越mRNA代謝的新功能。

圖2 YTHDF2結(jié)合m?A修飾的U6 snRNA并誘導(dǎo)其降解

3、YTHDF2通過(guò)U6 m?A甲基化控制炎癥基因表達(dá)

研究通過(guò)功能挽救實(shí)驗(yàn)證實(shí)，YTHDF2調(diào)控炎癥依賴(lài)于U6 snRNA。在HaCaT細(xì)胞中，敲低U6能夠逆轉(zhuǎn)因YTHDF2敲低引起的TNF-α、IL-6等炎癥因子上調(diào)。值得注意的是，體外合成的U6 RNA經(jīng)UVB照射后并不能誘導(dǎo)炎癥，說(shuō)明其效應(yīng)并非由UVB直接損傷引起，而是依賴(lài)于其內(nèi)在序列或修飾。METTL16敲低在A431細(xì)胞中模擬了YTHDF2敲低的促炎效應(yīng)，而此效應(yīng)同樣可被U6敲低所挽救。在YTHDF2敲除的細(xì)胞中，METTL16敲低不再進(jìn)一步加劇炎癥，證明YTHDF2位于METTL16的下游執(zhí)行功能。這些數(shù)據(jù)構(gòu)建了METTL16-m?A U6-YTHDF2軸調(diào)控炎癥的清晰路徑。

圖3 YTHDF2通過(guò)U6 m?A甲基化控制炎癥基因表達(dá)

4、YTHDF2與m?A U6結(jié)合從而抑制其與TLR3的結(jié)合

研究闡明了YTHDF2抑制炎癥的精確分子機(jī)制：與TLR3競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合U6。小規(guī)模siRNA篩選發(fā)現(xiàn)TLR3是介導(dǎo)YTHDF2敲低促炎效應(yīng)的關(guān)鍵受體。體外結(jié)合實(shí)驗(yàn)表明，重組TLR3可同等結(jié)合U6與m?A U6，而YTHDF2優(yōu)先結(jié)合m?A U6。在細(xì)胞內(nèi)，YTHDF2的存在使m?A U6與之結(jié)合，而非TLR3；一旦YTHDF2缺失，m?A U6則轉(zhuǎn)向與TLR3強(qiáng)力結(jié)合，激活炎癥。進(jìn)一步通過(guò)TLR3截?cái)囿w鑒定出U6結(jié)合其LRR21結(jié)構(gòu)域，而已知的dsRNA類(lèi)似物poly(I:C)結(jié)合的是LRR20域。這揭示了TLR3通過(guò)不同結(jié)構(gòu)域區(qū)分不同RNA配體，而YTHDF2通過(guò)“占據(jù)"m?A U6來(lái)阻斷其激活TLR3。

圖4 YTHDF2與m?A U6結(jié)合從而抑制其與TLR3的結(jié)合

5、U6與YTHDF2均定位于內(nèi)體

研究揭示了U6-TLR3通路激活的細(xì)胞器定位。細(xì)胞組分分離和免疫熒光實(shí)驗(yàn)證實(shí)，UVB照射或YTHDF2敲低會(huì)顯著增加U6在細(xì)胞質(zhì)和內(nèi)體中的聚集，并與內(nèi)體標(biāo)志物Rab7共定位。YTHDF2同樣被證實(shí)存在于內(nèi)體中。機(jī)制上，抑制內(nèi)吞作用的關(guān)鍵蛋白動(dòng)力或敲低RNA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白SIDT2，均能減少U6和YTHDF2在內(nèi)體中的富集，并降低U6穩(wěn)定性。重要的是，U6敲低會(huì)減少內(nèi)體中的YTHDF2，而YTHDF2敲低則增加內(nèi)體U6，說(shuō)明YTHDF2是跟隨U6進(jìn)入內(nèi)體的。使用動(dòng)力抑制劑Dynasore可抑制炎癥基因表達(dá)，證明U6進(jìn)入內(nèi)體是其激活TLR3所必需。

圖5 U6與YTHDF2均定位于內(nèi)體介導(dǎo)炎癥反應(yīng)

6、UVB irradiation抑制YTHDF2

研究揭示了UVB通過(guò)翻譯后修飾和蛋白降解兩條路徑抑制YTHDF2功能。質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)UVB照射后YTHDF2第39位絲an酸發(fā)生去磷酸化。Co-IP實(shí)驗(yàn)表明，去磷酸化削弱了YTHDF2與CNOT1（介導(dǎo)RNA降解的關(guān)鍵因子）的互作，并增強(qiáng)了與磷酸酶亞基MYPT1的互作，從而解釋了其功能失活。同時(shí)，UVB通過(guò)激活自噬降解YTHDF2蛋白，這一過(guò)程依賴(lài)于自噬受體p62。敲低自噬關(guān)鍵基因ATG5/7或p62，均可阻止UVB引起的YTHDF2下調(diào)及U6累積。這些發(fā)現(xiàn)闡明了環(huán)境應(yīng)激如何通過(guò)破壞YTHDF2的穩(wěn)定性和功能，導(dǎo)致U6累積并最終引發(fā)炎癥。

圖6 UVB irradiation抑制YTHDF2活化

7、YTHDF2通過(guò)抑制TLR3通路抑制皮膚腫瘤發(fā)生

研究最終將分子機(jī)制與腫瘤發(fā)生相聯(lián)系。功能實(shí)驗(yàn)表明，YTHDF2敲低促進(jìn)皮膚癌細(xì)胞增殖、遷移和裸鼠移植瘤生長(zhǎng)，而過(guò)表達(dá)則抑制這些表型。在慢性UVB誘導(dǎo)的小鼠皮膚癌模型中，皮膚特異性敲除YTHDF2顯著增加了腫瘤數(shù)量并加速了腫瘤發(fā)生。機(jī)制上，U6敲低或TLR3抑制均可逆轉(zhuǎn)YTHDF2敲低帶來(lái)的促瘤效應(yīng)。同樣，使用COX-2抑制劑Celecoxib也能抑制YTHDF2敲低細(xì)胞的增殖。對(duì)人類(lèi)皮膚鱗癌組織的分析顯示，YTHDF2蛋白水平顯著降低，且與腫瘤進(jìn)展負(fù)相關(guān)。這些結(jié)果確立了YTHDF2通過(guò)抑制U6-TLR3軸在皮膚腫瘤發(fā)生中扮演關(guān)鍵抑癌角色。

圖7 YTHDF2通過(guò)抑制TLR3通路抑制皮膚腫瘤發(fā)生

全文結(jié)論：

研究揭示了一條由METTL16–m?A U6–YTHDF2–TLR3構(gòu)成的全新信號(hào)軸，闡明了YTHDF2通過(guò)識(shí)別m?A修飾的內(nèi)源性U6 snRNA并促進(jìn)其降解，進(jìn)而競(jìng)爭(zhēng)性抑制U6與TLR3結(jié)合，從而在生理狀態(tài)下抑制炎癥反應(yīng)的核心機(jī)制。研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，UVB輻射通過(guò)誘導(dǎo)YTHDF2去磷酸化及p62介導(dǎo)的自噬降解雙重途徑破壞該調(diào)控軸，導(dǎo)致U6累積并激活TLR3信號(hào)，最終驅(qū)動(dòng)皮膚炎癥與腫瘤發(fā)生。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)證實(shí)YTHDF2具有抑制腫瘤的生物學(xué)功能，其表達(dá)在人類(lèi)皮膚癌及自身免疫病中顯著下調(diào)。該發(fā)現(xiàn)不僅拓展了m?A修飾與非編碼RNA在免疫調(diào)控中的功能認(rèn)知，也為相關(guān)疾病的治療提供了潛在新靶點(diǎn)。

研究意義與展望

本研究具有重要的理論與臨床意義。在理論層面，它突破了以往對(duì)m?A功能集中于mRNA的認(rèn)知，揭示了一種由m?A修飾的“自我"非編碼RNA（U6 snRNA）驅(qū)動(dòng)的先天性免疫激活新范式，將表觀轉(zhuǎn)錄組學(xué)、非編碼RNA生物學(xué)與免疫學(xué)緊密連接。其闡明的 YTHDF2作為“分子開(kāi)關(guān)"，通過(guò)競(jìng)爭(zhēng)性結(jié)合抑制TLR3過(guò)度激活的機(jī)制，為理解細(xì)胞內(nèi)如何區(qū)分并控制“自我"RNA的免疫原性提供了全新框架。

在臨床層面，該研究為炎癥性皮膚病、自身免疫疾病（如SLE）及皮膚癌的防治提供了新的潛在靶點(diǎn)。YTHDF2、METTL16或m?A U6本身，以及其下游的TLR3信號(hào)通路，均可作為潛在的干預(yù)窗口。例如，開(kāi)發(fā)小分子激動(dòng)劑以增強(qiáng)YTHDF2功能，或使用中和抗體阻斷U6與TLR3的結(jié)合，可能為緩解病理性炎癥和抑制腫瘤發(fā)生提供新策略。

此外，幾個(gè)關(guān)鍵問(wèn)題有待深入探索：首先，m?A U6在其它組織、炎癥類(lèi)型及癌癥中的作用是否普適？其次，YTHDF2的磷酸化調(diào)控網(wǎng)絡(luò)及其與自噬降解的串?dāng)_機(jī)制仍需細(xì)化。此外，能否開(kāi)發(fā)出靶向該通路的安全有效療法，并克服TLR通路調(diào)控可能帶來(lái)的脫靶效應(yīng)，是邁向臨床轉(zhuǎn)化的核心挑戰(zhàn)?？傊?，這項(xiàng)工作開(kāi)辟了一個(gè)充滿(mǎn)前景的研究方向，預(yù)示著靶向RNA修飾及其閱讀蛋白可能成為未來(lái)免疫代謝疾病治療的新前沿。