免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)實驗

簡要描述：

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)實驗是以抗體和抗原之間的專一性作用為基礎的用于研究蛋白質相互作用的經(jīng)典方法。是確定兩種蛋白質在完整細胞內生理性相互作用的有效方法。當細胞在非變性條件下被裂解時，完整細胞內存在的許多蛋白質－蛋白質間的相免疫共沉淀互作用被保留了下來。

更新時間：2024-07-26

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產品介紹

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)實驗

免疫共沉淀(Co-Immunoprecipitation)實驗流程：

樣品準備

將不同分組的細胞從培養(yǎng)箱中取出（每組2個10cm的皿），在冰上用預冷的PBS洗一遍，加入裂解液（20mM Tris-HCL Ph7.5、150 mM Nacl、1%TritonX-100、1 mM EDTA和蛋白酶抑制劑），用細胞刮裂解細胞。13000rpm 4℃離心10min，去上清進行蛋白定量。定量后原液備用。

蛋白定量

1 標準曲線的繪制：取一塊酶標板，按照下表加入試劑

孔號	1	2	3	4	5	6	7	8
蛋白標準液（μl）	0	2	4	6	8	12	16	20
去離子水（μl）	20	18	16	14	12	8	4	0
蛋白濃度（μg/μl）	0	0.05	0.1	0.15	0.2	0.3	0.4	0.5

2. 根據(jù)樣品數(shù)量，將BCA試劑A與試劑B按體積比為50:1配制適量BCA工作液，充分混勻；

3. 各孔加入160μl BCA工作液；

4. 把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘，然后在562nm下測定吸光度。以吸光值為橫坐標，蛋白濃度（μg/μl）為縱坐標，繪出標準曲線；

5. 在酶標板中加入2μl待測蛋白和18μl PBS（稀釋10倍），加入160μl BCA工作液，把酶標板放在振蕩器上振蕩30sec，37℃放置30分鐘，然后在562nm下測定吸光度。

6. 根據(jù)所測樣品的吸光值，在標準曲線上即可查得相應的蛋白濃度（μg/μl），乘以樣品稀釋倍數(shù)（10）即為樣品實際濃度（單位：μg /μl）。

共沉淀
根據(jù)蛋白定量結果，將各組蛋白留取適量用于做input對照；
分別取各組細胞蛋白置于2個1.5ml離心管中（2mg每管），其中一個加入2ug IgG，另外一個加入2ug IP指標對應的抗體，冰上孵育2h；
分別向兩個管子中加入protein G-Agarose beads（Roche），加裂解液至1ml。4℃旋轉混勻，孵育過夜；
2500rpm，4℃離心1min，去上清，1ml裂解液洗滌沉淀4次；
加入2×蛋白上樣緩沖液，輕輕混勻后煮沸5min，2500rpm離心1min，棄沉淀；
將上清轉移至新的離心管中，用于western blot檢測相應蛋白。
PAGE膠的制備

1. 下層分離膠的制備

根據(jù)目的蛋白的分子量選擇不同的凝膠濃度，高分子量蛋白用低濃度膠，低分子量蛋白用高濃度膠分離。 GRα 90kDa AP-1 43.48kDa IkB 39kDa STAT3 79， 86kDa NF-KB p65 故選用10%的膠。不同濃度的分離膠按下表進行配制，待下層膠凝固后進行上次濃縮膠的配制。

2. 上層濃縮膠的配制

根據(jù)需要按下表配制濃縮膠，并插好梳子。

上樣及電泳

1. 上樣

每孔上樣量約為20ul蛋白，可以根據(jù)實驗要求加大上樣量。將配制好的PAGE膠放入電泳槽中，加入適量電泳緩沖液，取下梳子用槍輕輕吹打加樣孔，避免孔內有余膠殘留影響上樣。將準備好的樣品用加樣槍慢慢加到對應的孔內，注意勿溢出加樣孔。

2. 電泳

一般濃縮膠80V 20分鐘，分離膠120V 60分鐘，可以根據(jù)具體實驗要求調整電壓和時間。當染料到達膠底部時切斷電源，停止電泳，進行下一步轉膜。

轉膜

轉膜分為濕轉和半干轉，本實驗室選用半干轉。

半干式轉膜中，三明治的排列為：/慮紙/膠/膜/慮紙，用電轉緩沖液浸濕后，直接置于電轉儀的正負極之間。膠于負極而膜置于正極。半干式的電轉緩沖液不同于濕式的電轉緩沖液，推薦為：48 mM Tris, 39 mM glycine, 0.04% SDS, 20%甲醇。25V轉膜30分鐘即可。轉膜前將PVDF膜在甲醇中浸泡1-2 分鐘（NC膜在電轉液中浸泡10-20分鐘），再孵育于冰冷的電轉緩沖液中5 分鐘，膠也需在冰冷的電轉緩沖液中平衡3-5 分鐘，否則轉膜時會導致條帶變形。

膜上蛋白的檢測

為檢測轉膜是否成功，可用麗春紅染色，麗春紅染色工作液：2%的麗春紅貯備液1：10 稀釋，即加9 倍的ddH₂O

染色方法：將膜放入TBST 洗一次，再置于麗春紅染色工作液中,在室溫下?lián)u動染色5 分鐘，大量的水洗膜直至水變清無色蛋白條帶清晰，（膜也可以用TBST 或水重新洗后再進行染色）PVDF 膜需用甲醇再活化后用TBST洗后進行封閉。

膜的封閉及抗體孵育

1. 封閉：5%脫脂奶粉（檢測磷酸化蛋白用BSA）室溫封閉1小時或4℃過夜。

2. 一抗：根據(jù)說明書GRα 1:800 AP-1 1:1000 IkB 1:1000 STAT3 1:1000 NF-KB 1：1000 稀釋抗體，抗體加入封閉液中稀釋到所需濃度，和膜室溫孵育2小時或4 ℃孵育過夜。

3. 二抗：孵育一抗的膜用TBST洗滌3次，每次5min。隨后根據(jù)用量，按照1:1000稀釋HRP標記的二抗，與膜37℃孵育1h。用TBST洗滌3次，每次5min。

顯色

ECL化學發(fā)光檢測：配制ECL發(fā)光液，根據(jù)用量，取ECL發(fā)光液A和B等量混勻，加在膜的正面暗室避光5分鐘。倒掉顯色液，用紙小心吸取顯色液，在上面蓋上一層平整的透明紙。將其放入成像系統(tǒng)中進行掃描?？梢愿鶕?jù)條帶強弱再次感光或減短感光時間已達到理想結果。